Synthese von funktionellen Tetrazinen als bioorthogonale Sonden für die molekulare Bildgebung
Im Forschungsgebiet der bioorthogonalen Chemie werden chemische Reaktionen entwickelt und angewendet, die unter hochkomplexen Bedingungen in lebenden Organismen höchstselektiv ablaufen können (in vivo Chemie). Trotz einer Vielzahl erster faszinierender Anwendungen befindet sich die bioorthogonale Chemie noch in ihren Anfängen.
Ein Reaktionstyp, der die Anforderungen einer bioorthogonalen Reaktion erfüllt und in letzter Zeit stark an Popularität gewonnen hat, ist die Diels-Alder (DA) Cycloaddition mit inversem Elektronenbedarf zwischen Tetrazinen und trans-Cyclooctenen (TCO).
Diese äußerst schnelle Reaktion läuft selbst in lebenden Zellen und Organismen höchstselektiv ab und wird aktuell in der Entwicklung von vielversprechenden diagnostischen als auch therapeutischen Strategien eingesetzt. Als Beispiel seien hier zweistufige Methoden zur selektiven Bildgebung („Pretargeted Imaging“) angeführt. Dadurch können langsame Prozesse, wie zum Beispiel die selektive Anreicherung von monoklonalen Antikörpern in Tumorgewebe, mit kurzlebigen Radioisotopen (z.B. Fluor-18) mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) visualisiert werden. Zudem kann mit dieser Methode die Strahlenbelastung für die PatientInnen verringert werden.
Das Ziel der Arbeit war die Synthese von modifizierten Tetrazinen als bioorthogonale Sonden für Anwendungen im Bereich der molekularen Bildgebung mittels Fluoreszenzmikroskopie. Dazu wurden unterschiedliche Synthesestrategien entwickelt und angewendet, um verschiedene fluorogene Tetrazine herzustellen, die nach der Reaktion mit TCO um ein Vielfaches stärker fluoreszieren (sogenannte „turn-on Tetrazine“). Die einzelnen Syntheseschritte wurden optimiert und auf deren Praktikabilität getestet. Die chemische Struktur der synthetisierten Verbindungen wurde anschließend mittels analytischer Methoden (Massenspektrometrie, NMR) verifiziert.
Auf Basis der erzielten Resultate soll in Zukunft die Synthese von Tetrazinen erleichtert sowie die Herstellung von neuen bioorthogonalen Verbindungen ermöglicht werden.
Bertozzi, C. R. A decade of bioorthogonal chemistry. Accounts of Chemical Research 44, 651–653 (2011).
Mayer, S. & Lang, K. Tetrazines in Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Cycloadditions and Their Use in Biology. Synthesis 49, 830–848 (2017).
Matthias Schöberl, Patrick Ringl Mag. Dr. Peter Siengalewicz (interner Betreuer)
DI Dr. Hannes Mikula (externer Betreuer)
Vergleich von unterschiedlichen Dextranaseproduzenten im Klein- und Großmaßstab
Die grundlegende Idee dieser Arbeit bestand darin, den bestmöglichen Dextranaseproduzenten unter verschiedensten Bedingungen zu finden, welcher zukünftig großtechnisch eingesetzt werden soll. Dazu wurden drei verschiedene Mikroorganismen herangezogen und miteinander verglichen.
Produktion von Dextranase mithilfe verschiedener Mutanten des Pilzes Chaetomium gracile in Schüttelkolbenexperimenten:
Der Pilz Chaetomium gracile wurde im Vorfeld bereits mit UV-Strahlen behandelt. Die dabei generierten Mutanten wurden unter verschiedenen Bedingungen in unterschiedlichen Nährmedien in mehreren Screeningrunden kultiviert. Die Dextranaseproduktion der einzelnen Stämme wurde dem unbehandelten Wildtypen gegenübergestellt.
In allen getesteten Nährmedien konnte Dextranaseaktivität gemessen werden, jedoch zeigte der Zusatz von Glucose beziehungsweise Saccharose eine hemmende Wirkung. Zwischen Wildtyp und Mutanten war kaum ein Unterschied erkennbar, wobei die maximale Aktivität der Dextranase bei einer der Mutanten mit knapp unter 300 U/mL gemessen werden konnte.
Screening der Hefe Lipomyces starkeyii als alternativen Dextranaseproduzenten:
Da nur unzureichende Informationen zur optimalen Kultivierung der Hefe Lipomyces starkeyii für die höchstmögliche Dextranaseproduktion vorliegen, wurde die Hefe in unterschiedlichen Nährmedien angezüchtet und deren Dextranaseproduktivität verglichen. Das Ziel hierbei war es, die Produktivität der Hefe der des filamentösen Pilzes Chaetomium gracile gegenüberzustellen.
Bei den hierbei herangezogenen Nähmedien konnten keine essentiellen Unterschiede gefunden werden, obwohl deren Zusammensetzung in verschiedensten Punkten (Kohlenstoff-, Stickstoffquellen, etc.) variierte. Da Aktivitätswerte von höchstens 4 U/mL erzielt werden konnten, ist diese Hefe im Gegensatz zum Pilz großtechnisch nicht einsetzbar.
Fermentation von zwei Dextranaseproduzenten im Klein- und Großmaßstab:
In diesem Teil der Arbeit wurden der Pilz Chaetomium gracile und die Hefe Lipomyces starkeyii bezüglich ihrer Produktivität des Enzyms Dextranase miteinander verglichen. Zur Kultivierung wurden Bioreaktoren im drei- beziehungsweise zwanzig Litermaßstab herangezogen, in denen die Messparameter exakt eingestellt und konstant gehalten wurden.
Durch die Fermentationen wird ersichtlich, dass die Hefe ihre exponentielle Phase zwar um ein Vierfaches schneller erreicht als der Pilz, da die gebildete Dextranase jedoch Aktivitätswerte von 3 U/mL nicht überschreitet wird die Dextranaseproduktion durch den Pilz nach der gleichen Kultivierungsdauer mit Werten von 6,3 U/mL bevorzugt.